圭臬依据：《GB/T 34224-2017 生物居品中功能性微生物检测》 西田あかり最新番号

1 缔造和材料

除微生物施行室通例灭菌及培养缔造外，其他缔造和材料如下。

1.1 恒温培养箱和恒温厌氧培养箱:37℃士1℃。

1.2 雪柜:2℃～5℃。

1.3 天平:感量为0.1g。

1.4 均质器及无菌均质袋，均质杯。

1.5 飘舞器。

1.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)，10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

1.7 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。

1.8 无菌培养皿:直径90mm。

1.9 显微镜:10倍一100倍。

1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2 培养基和试剂

2.1 KF链球菌琼脂培养基。

2.2 肠球菌肉汤。

2.3 无菌生理盐水。

2.4 革兰氏染色液。

2.5 细菌生化武断试剂盒。

3 锻真金不怕火程序

粪肠球菌的锻真金不怕火程序见下图。

4 操作时间

4.1 样品制备

4.1.1 固体和半固体样品

称取25g样品，置于225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打lmin～2min制成1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质lmin～2min制成1:10的样品匀液。

4.1.2 液体样品

应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置安妥数目的无菌玻璃珠)中，充分振摇﹐制成1:10的样品匀液。

4.2 样品稀释

4.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取l:10样品匀液lmL，沿管壁逐渐注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中(翔实吸管顶端不要涉及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复奏乐使其夹杂均匀，制成l:100的样品匀液。

4.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作规定，作念10倍递加样品匀液，每递加稀释一次，即换用1次lml灭菌吸管或吸头。

4.3 培养

左证对待检样品菌含量的推断，选拔2个～3个贯穿的顺应稀释度﹐每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于KF链球菌琼脂平板内，使用涂布棒尽可能预防快速地涂布接种液于琼脂名义，涂布棒不得讲和平皿角落。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10 min使接种物统统被培养基招揽。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。

4.4 菌落计数

4.4.1 录取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无推广菌落滋长的平板计数菌落总和。低于30 CFU的平板纪录具体菌落数，大于300 CFU的可纪录为多不行计。每个稀释度的菌落数应经受两个平板的平均数。

4.4.2 其中一个平板有较大片状菌落生万古，则不宜经受，而应以无片状菌落滋长的平板动作该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落漫衍又很均匀，即可磋议半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

4.4.3 当平板上出现菌落间无昭彰界线的链状生万古，则将每条单链动作一个菌落计数。

4.5 武断

4.5.1 菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个暗红色至粉红色，名义光滑，附进整皆的菌落分歧转入肠球菌肉汤培养基37℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h后进行样式学、生化武断。

4.5.2 样式学武断

革兰氏染色，镜检。粪肠球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或卵形，直径0.5u.m～1.0um，成对或短链状枚举，无芽孢。

4.5.3 生化武断

使用细菌生化武断试剂盒进行生化武断。辩认特征参见表B.5。肠球菌属常见菌种主要武断特征见表C.2。

5 效劳磋议

5.1每个平板中粪肠球菌的数目

每个平板中粪肠球菌菌落数的磋议见式(1):

  a=b/A×C                ...............（1）

  式中

  a-每块平板上的粪肠球菌菌落数；

  b-挑取后经证据为粪肠球菌的菌落数；

  A-挑取平板上用于考据的菌落数；

  C-平板上的所有特征菌落数。

5.2 菌落总和的磋议举止

5.2.1 若唯唯独个稀释度平板上的菌落数在顺应计数范围内，磋议两个平板中粪肠球菌菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，动作每克(毫升)中菌落总和效劳。

5.2.2 若有两个贯穿稀释度的平板菌落数在顺应计数范围内时，按式(2)磋议:

  N=∑C/（n1+0.1n2）×d       ...............（2）

  式中:

  N-样品中菌落数;

  ∑C-平板(含顺应范围菌落数的平板)菌落数之和；

  n1-第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；

  n2-第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；

  d-稀释因子(第一稀释度)。

6 陈说

6.1 效劳判定

若样品菌落安妥粪肠球菌样式学及生化武断的特征，可判定为粪肠球菌。

6.2 效劳陈说

6.2.1 定性陈说

在25g(mL)样品中检出或未检出粪肠球菌。

6.2.2 定量陈说

菌落数小于100CFU时，以整数陈说。菌落数大于或便是100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后头用0代替位数；也可用10的指数体式来示意，经受两位有用数字。

  本文节选自《GB/T 34224-2017 生物居品中功能性微生物检测》。

附：

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GB/T 34224-2017 生物居品中功能性微生物检测圭臬用到的培养基 点击下载

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