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曼谷 人妖 真核哺乳动物细胞标签卵白纯化
发布日期：2024-08-29 09:24    点击次数：101

曼谷 人妖 真核哺乳动物细胞标签卵白纯化

简介哺乳动物抒发系统的杰出优点是抒发卵白可正确折叠以及进行糖基化等翻译后修饰曼谷 人妖，抒发产物具有生物活性，已成为抒发和坐褥卵白质药物，基因工程抗体，疫苗抗原和估量用观念卵白功能的优选抒发体系。哺乳动物抒发体系卵白抒发的主要进程为：PCR扩增观念片断——将基因片断克隆到抒发载体上——细胞转染——细胞株的筛选和培养——纯化观念卵白 

措置决议1、查找观念基因序列由于引物是证据观念基因序列来筹划的，是以查找到观念基因序列是筹划引物的第一步。查找观念基因序列不错在多个网站上查到，也不错在文件中查找。这里先容的是比拟常用的NCBI网站查找基因序列的方法。NCBI是好意思国国度生物本事信息中心，网站上具有多个生物数据库，是生物学估量常用的网站。

1.1绽开NCBI网站，鄙人拉框接管Gene，输入观念卵白称号；（这里以p65为例） 

1.2 找到对应物种，也不错接管右侧框中的物种查找； 

1.3 页面往下拉，找到mRNA and Protein(s)，接管正确的isoform，NMxxx默示mRNA序列，NPxxx默示卵白质序列； 

1.4 新页面往下拉，点击CDS，点击右侧FASTA，即可得到观念基因的mRNA序列，复制粘贴到新的文本，以备使用。 

2、接管合适的抒发载体

常用的真核抒发载体有pCMV，pcDNA等。抒发载体一般包括启动子，多克隆位点，抗性基因，标签基因等等。

抒发载体的接管原则：1）启动子是否为真核启动子；2）标签基因是否是咱们需要用的标签。常用的标签的标签有His，GST，MBP，Strep，Flag标签等，标签接管如下： 

3、筹划引物筹划引物也有多个软件不错使用，这里先容的是常用的Primer 5软件。筹划引物的基本原则是：1）引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不行大于38bp；2）引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，高下流引物GC含量和Tm值要保捏接近；3）引物所对应的模板序列的Tm值最佳在72℃掌握；4）3'端最佳不如若一语气碱基，GGG或CCC会导致诞妄的激发，同期3'端终末一个碱基最佳不如若A或T，不然容易导致错配；5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计划Tm值，也即是退火温度。接管较低Tm值的引物的退火温度为响应的退火温度，最佳保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范畴内；6）在DNA测序和PCR中最佳用5'终端富厚（GC含量多），而3'端不富厚（AT含量多）的引物，这种引物的结构不错灵验地摈弃假激发响应；7）引物和产物之间的Tm值相离别太大，20摄氏度范畴内最佳。

此外，在引物的两头需要加上酶切位点和保护碱基。为了保证基因序列的场地性，而且注重自连，当今基本上都接管双酶切位点。酶切位点的接管原则：1）酶切位点存在于载体上，不存在于基因序列中；2）两个酶最佳有共同的缓冲体系；3）两个酶在载体上酶切位点位置不行太近。如果载体上莫得标签序列，还需要在引物筹划时加上标签序列。

怎样笃定酶切位点3.1  绽开Primer 5，接管file - new -DNAsequence，输入上述保存的CDS序列，点击As Is； 3.2  点击左侧Enzyme框，看一下载体上接管的双酶切位点是否在右侧框中，如果不在，从左侧框中添加到右侧框中； 3.3  点击OK即可检讨CDS序列中有无选择的酶切位点，如果选择的双酶切位点存在于观念卵白的CDS序列中，需从头接管双酶切位点。 

怎样筹划引物3.4 绽开Prime 5软件，点击File——New——DNA Sequence 3.5 点击空缺处粘贴咱们之前找好的观念基因的CDS序列，接管As is。 3.6  点击左上角的Primer，S为正向引物，A为反向引物  3.7  点击Edit Primers裁剪序列，可调动引物是曲，添加酶切位点序列以及保护碱基。如果暴露Hairpin，Dimer，False Priming，Cross Dimer大略Tm值太高或太低，则需要调动。 

如果检测引物特异性3.8  NCBI主页最下端找到Primer-BLAST，绽开； 3.9  输入高下流引物序列，点击最下方 ； 3.10  如果只可检测到你的观念卵白基因，则标明特异性较好。

拿到合成的引物之后，咱们就不错进行观念基因的扩增了。合成观念基因通常是以指标物种的基因组为模板。由于真核生物的基因组中存在内含子序列，在mRNA的剪接加工过程中被切除，因此，在构建真核基因克隆时基因组DNA不行平直用作PCR扩增的模板，只可从细胞大略组织中索取总RNA大略mRNA，回转录cDNA行为模板通过PCR扩增观念基因。

4、从细胞中索取总RNA4.1  从细胞培养箱中取出依然长满细胞的细胞培养皿，小心吸出培养基，加入4ml预冷PBS，歪斜细胞培养皿3次以充分洗涤细胞，然后小心吸尽PBS溶液。4.2  培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞，冰上静置5min，枪头奏乐，室温静置5min；4.3  将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加入CHCl₃ 0.2 ml，触动仪触动15s。4.4  室温静置2-3min，12000xg，4℃，15min离心。4.5  离心后液体分为三层（表层无色为RNA，中层为DNA，底层为卵白质），小心吸取表层无色液体至新的EP管中。4.6  加入等体积异丙醇，混匀，冰上静置10min，12000xg，4℃，10min离心。4.7  此时在管底可见RNA白色千里淀，弃去上清。4.8  加入75%酒精1ml，触动仪触动30s，7500xg，4℃，5min离心。4.9  小心去上清，管内千里淀在超净台中饱读风静置干燥3-5min。4.10  加入20ul DEPC水溶解。水浴大略加热器55-60℃，10-15min。4.11  测定纯度和浓度。吸光度A260/280比值接近2标明纯度较高。部分联系居品曼谷 人妖

货号 称号 规格 用途 abs9331 RNA索取试剂盒 100ml RNA索取试剂盒 25050070 Amersham RNAspin Mini Kit 20T RNA索取试剂盒

 

5、回转录取得cDNA回转录通常使用试剂盒和PCR仪器进行操作，这里参照了爱必信的RT-PCR Kit居品说明书进行先容。居品组分： 执行方法：5.1  将 RNA 模板、引物、2×One-Step RT-PCR SuperMix，RT Enzyme Mix 和RNase Free Water 溶解并置于冰上备用。5.2  设置以下响应体系： 5.3  轻轻混匀后顷然离心，使管壁上的溶液蚁集到管底。5.4  常用响应方法： 5.5  响应完成后，测定纯度和浓度。部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs60076 回转录试剂盒 50T 回转录试剂盒 27925901 Amersham Ready-To-Go RT-PCR Beads 0.2ml 回转录试剂盒

6、观念基因的扩增观念基因的扩增通常亦然使用试剂盒和PCR仪器完成。这里参照了爱必信的2xPfu Master Mix居品说明书进行先容。注：扫数组分应仔细混匀并离心后开启，扫数 PCR操作过程应在冰上进行。操作示例：以50 μl PCR响应体系为例 。6.1  按照下表配制 PCR响应体系 *模板量：1-2 μl RT-PCR响应后的 cDNA。6.2  PCR响应轮回的耕作 6.3  终结检测：取 2-5 μl响应液电泳不雅察终结，测定纯度和浓度。

观念基因扩增之后，就要将观念基因和抒发载体并吞在沿途。通常使用酶切并吞的方法，将观念基因和抒发载体永别用通常的两个截止性内切酶进行双酶切，得到互补的酶切位点，然后用T4并吞酶将这两部分并吞在沿途。观念基因扩增之后，观念基因存在的缓冲体系可能会影响到酶切服从，是以通常先进行观念基因的纯化，也叫作切胶回收。

部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs60057 2×HotStart Taq PCR Mix 5×1ml 观念片断DNA扩增 abs60055 2×Pfu PCR MasterMix 5×1ml 观念片断DNA扩增

 

7、观念基因的纯化先进行跑胶，然后进行切胶回收。切胶回收通常也使用试剂盒进行操作，这里参照爱必信的DNA Gel/PCR Purification Kit居品说明书进行先容。7.1  取50xTAE缓冲液20ml加水至1000ml，配制成1xTAE电泳缓冲液，备用。7.2  称取0.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 1xTAE电泳缓冲液，在微波炉里加热至琼脂糖全部溶化，取出摇匀。加热过程中要时常摇动，使琼脂糖在溶液中散播均匀。7.3  在制胶槽中插好梳子，向冷却的琼脂糖中加入GelRED染色剂，平缓倒入制胶槽中。把制胶槽放入电泳仪中，在电泳仪中倒入TAE电泳缓冲液。7.4  将50ul PCR产物中加入10ul 6x loading buffer并混匀，用移液器小心加入到加样孔中。在掌握的孔中加入核酸Marker。7.5  加样完成后，盖上电泳仪盖子，启动电源。电压通常耕行为100V，当溴酚蓝指点跑到稳健位置时，关闭电源罢手电泳。7.6  将凝胶改变至核酸检测仪中，在紫外灯下快速准确的切下含有观念DNA片断的琼脂糖凝胶块，母子姐弟放进1.5ml离心管中。以下为爱必信DNA Gel/PCR Purification Kit居品说明书进行胶回收先容。居品组分： 7.7  DNA吸附柱均衡处理：向Gel Recovery Column中加入200μl buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉蚁集管中的废液，将Gel Recovery Column从头放回到蚁集管中。再向Gel Recovery Column中加入200μl的ddH2O，12000rpm离心1min，倒掉蚁集管中的废液。将Gel Recovery Column从头放回到蚁集管中。7.8  从琼脂糖凝胶中切下含有观念片断的凝胶，忖度分量或精准称量分量。每100mg 1%琼脂糖凝胶加入100μl Binding Solution。7.9  于50-60℃水浴5-10min，时间每2-3min辩别幽微荒谬混匀，直至胶块竣工溶化。7.10  于50-60℃水浴5-10min，时间每2-3min辩别幽微荒谬混匀，直至胶块竣工溶化。7.11  将吸附柱从头放回蚁集管中，加入500μl WA Solution，于12000rpm离心1min，倒掉蚁集管中废液。7.12  将吸附柱从头放回蚁集管中，加入500μl Wash Solution，于12000rpm离心1min，倒掉蚁集管中废液。7.13  类似上个容颜一次。7.14  将吸附柱从头放回蚁集管中，12000rpm离心1min，绽开吸附柱盖子，室温摈弃5-10min或50℃摈弃3-5min，以澈底去除Wash Solution。7.15  将吸附柱放入干净的1.5ml蚁集管中（试剂盒自带），关于膜中央悬空加入30-50μl Elution Buffer，盖好盖子，37℃摈弃2min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为包含观念基因的溶液。7.16  检测纯度及浓度。

部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs60098 PCR & DNA Fragment Purification Kit 50T DNA片断胶回收试剂盒 28104 QIAquick PCR Purification Kit 50T DNA片断胶回收试剂盒

 

8、观念基因和抒发载体的双酶切酶切操作提议参考购买的截止性内切酶的使用说明书，这里先容老例方法。8.1  在两个PCR管均永别羼杂以下身分：抒发载体酶切：

抒发载体 2ug 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul ddH2O 补都至30ul

PCR产物酶切：

观念片断 43ul 10x缓冲液 5ul 酶1 1ul 酶2 1ul

8.2  轻弹管壁混匀，顷然离心。8.3  放入PCR仪中，37℃，3h。8.4  跑电泳进行胶回收。

9、观念片断和抒发载体的并吞9.1  取PCR管，加入酶切后的抒发载体片断2ul，酶切后的观念基因片断6ul，T4 DNA并吞酶1ul，10* T4 buffer 1ul，轻弹管壁混匀，顷然离心。9.2  放入PCR仪中，16℃过夜。部分联系居品

货号 称号 规格 用途 28954549 PGEX-4T-1 25ug 抒发载体 28954648 PGEX-6P-1 VECTOR 25ug 抒发载体 abs60084 T4 DNA Ligase 500U 并吞酶 abs60085 T-Vector快速克隆试剂盒 20T 老例克隆 abs60089 pBM21快速克隆试剂盒 20T/3×20T 老例克隆 abs60091 T-Vector pTOPO快速克隆试剂盒 20T/100T TOPO克隆 abs60095 pBM16A Toposmart快速克隆试剂盒 20T/3×20T TOPO克隆 abs9314 核酸预制胶 10片/盒 核酸预制胶 abs60002 DL 2000 DNA Marker 100T(250ul×2支) DNA Marker

10、滚动观念基因与载体的并吞响应中，存在多种可能的并吞形状，除了正确并吞外，也可能出现载体和载体并吞，观念基因和观念基因并吞，大略部分并吞的情况，因此需要把正确并吞的重组质粒筛选出来。通常将并吞产物滚动到大肠杆菌中，通过菌落PCR大略酶切封锁的方法筛选出阳性克隆株，然后送到测序公司进行测序。测序准确的阳性克隆株就不错进行巨额扩增和保存。常用的大肠杆菌感受态细胞为DH5α大略TOP十。10.1   取出感受态大肠杆菌，放于冰上使其逐步溶化。10.2  将并吞产物加入100ul感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。10.3  将EP管放入42℃水浴箱中热激90秒，再赶紧放于冰上2分钟。10.4  EP管中加入400u LB培养基，置于摇床上，37℃，500rpm培养45分钟。部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs60101 DH5α 感受态细胞 10×100ul/20×100ul 感受态细胞

 

11、涂板培养500rpm离心1-2分钟，留100ul培养基上清，将滚动后的大肠杆菌轻轻混匀，涂于含抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中荒谬培养过夜。

12、挑克隆及阳性克隆株封锁挑取3-5个单克隆永别放入不同的离心管中（如果菌落未几不错全部挑取），此时不错进行菌落PCR和酶切封锁。1）菌落PCR同质粒构建时的PCR扩增，使用通常的引物，模板换成挑出的菌落；跑胶如果有扩增的条带则为阳性克隆株；2）酶切封锁菌落提质粒，使用质粒构建时的酶进行酶切；跑胶如果看到观念片断则为阳性克隆株；部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs9224 Ampicillin Sodium 5g/25g/100g 氨苄抗生素 abs60057 2×HotStart Taq PCR Mix 5×1ml 观念片断DNA扩增 abs60055 2×Pfu PCR MasterMix 5×1ml 观念片断DNA扩增 abs9314 核酸预制胶 10片/盒 核酸预制胶 abs60002 DL 2000 DNA Marker 100T(250ul×2支) DNA Marker

13、质粒索取酶切封锁需要提质粒，如果平直送公司测序，此步也可不详。索取质粒一般亦然使用试剂盒进行操作，这里参照爱必信的质粒小量快速索取试剂盒居品说明书进行先容。居品组份： 执行方法：13.1  向吸附柱AC 中（吸附柱放入蚁集管中）加 500μl 的均衡液 BL，12，000rpm 离心1min， 倒掉蚁集管中的废液，将吸附柱从头放回蚁集管中。13.2  取 1.5-4.5 毫升过夜培养的菌液 12，000rpm 离心 30sec，尽可能的倒干上清，蚁集菌体。13.3  用 250μl 溶液 P1 重悬菌体千里淀，涡旋飘浮至澈底悬浮。13.4  加 250μl 溶液 P2，慈悲地高下翻转 4 -7 次（裂解时候不跳动 5min）使菌体充分裂解。13.5  加 350μl 溶液 P3，立即慈悲地高下翻转 4 -7 次，充分混匀，此时会出现白色絮状千里淀，12，000rpm 离心 5 min。13.6  将上清加入到过滤柱E中（过滤柱放入 1.5ml或2ml离心管中），12，000rpm离心2 min，蚁集液体。如上清量较大，请分两次离心。13.7  将上述液体转入吸附柱 AC 中（吸附柱放入蚁集管中），12，000rpm 离心 30-60 sec，倒掉管中的废液。 可选容颜: 所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株时，由于核酸酶含量丰富， 应加入 500μl 去卵白液 PD，12，000rpm 离心 30-60 sec，弃废液。13.8  加入 500μl 漂洗液 WB（请先查验是否已加入无水酒精!），12，000rpm 离心 30-60sec 弃掉废液。13.9  类似上个容颜。13.10  将吸附柱 AC 放回空蚁集管中，12，000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温摈弃数min，以澈底晾干吸附材料中残余的漂洗液， 以免漂洗液中残留酒精抑遏下流响应。13.11  取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，室温放几分钟。13.12  在吸附膜的中间部位加 50μl-100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事前在 65-70℃水浴中加热服从更好），室温摈弃 2 min，12，000rpm 离心 1 min。如果需要较巨额质粒，可将得到的溶液从头加入离心吸附柱中，离心 1 min。(注重：若用 ddH2O 作念洗脱液，应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范畴内，pH 值低于 7.0 会训斥洗脱服从。洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl，体积过小影响回见服从。且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。)部分联系居品

货号 称号 规格 用途 abs60023 质粒小量快速索取试剂盒 50T 质粒索取试剂盒 12943 Plasmid Plus Midi Kit 25T 质粒索取试剂盒 12243 QIAfilter Plasmid Midi Kit 25T 质粒索取试剂盒

14、测序封锁后的阳性克隆株进行培养，送公司测序。测序到手的菌株进行培养和保存。

15、观念卵白的抒发观念卵白抒发通常使用293细胞大略CHO细胞。将封锁到手后的克隆株培养之后，索取重组质粒。然后将重组质粒转染到细胞中。提质粒可参考前文容颜。15.1  细胞复苏在无菌超净台中霸术培养瓶，加5ml预热培养基，盖好瓶盖待用。将细胞从液氮中取出，置于37℃水浴中赶紧解冻，用酒精棉球擦抹后移至超净职责台，（如果需要去除冷冻保护剂，举例DMSO或Glycerol，则先800rpm离心3min，吸出冷冻保护剂），加入少许培养基奏乐并混匀细胞，吸入至培养瓶中。

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15.2  细胞传代1、取出细胞培养瓶，吸出培养基，加1ml PBS润洗细胞，吸出PBS丢弃；2、加入1ml胰酶，轻轻涟漪培养瓶使浸润扫数细胞，放入37℃培养箱中；3、加入2ml含血清的培养基终止消化，奏乐细胞使细胞零碎；4、蚁集细胞悬液至离心管中，1200rpm离心3min，吸出上清；5、加入簇新培养基，奏乐混匀，永别加入到两个培养瓶中。注：如果是悬浮细胞，则无需消化容颜。

15.3  细胞计数1、使用胰酶消化细胞，加入含血清的培养基终止消化。2、如果需要检讨细胞活性，可使用台盼蓝染色。取180ul的细胞液至EP管中，加入20ul台盼蓝母液（4%台盼蓝），用移液器奏乐混匀；3、取10ul含有台盼蓝的细胞液加入细胞计数器中，使用显微镜进行细胞计数。

15.4 细胞转染细胞转染常用的方法有脂质体转染法，电穿孔转染法，病毒转染法等等，这里以Polyplus的JetPRIME转染试剂为例进行先容。1、为了达到好的转染情状，一般接管细胞交融度为60%-80%时进行转染。推选的细胞数不错参考以下表格： 2、稀释X ug的质粒至W ul的JetPRIME缓冲液中，触动10s，瞬离；3、加入Y ul JetPRIME试剂至上一步的羼杂物中；4、触动1s，瞬离，室温孵育10min；5、把转染羼杂物加至细胞培养瓶中。具体体积参考下表： 

15.5  卵白检测取细胞加裂解液进行细胞裂解，取部分上清和6xloading buffer羼杂，在95℃加热5min。使用SDS-PAGE进行跑胶并用考马斯亮蓝 R250进行染色，检测卵白抒发。部分联系居品

  货号 称号 规格 用途 培养基 12-770Q PowerCHO-1 serum-free medium 1L 1L 无血清和非动物起原培养基 BEBP12-932Q eCHO Feed Medium - 1L bottle 1L CHO细胞培养基 BEBP12-764Q Pro293 a Serum-free Medium – Chemically Defined for 293 Adherent Cells 1L 用于293贴壁细胞培养，重组卵白坐褥 BEBP02-030Q ProVero 1 Serum-free Medium 1L 培养基，用于MDCK和vero细胞的滋长 转染试剂 301105 PolyFect Transfection Reagent 1ml 细胞转染试剂 116-001 FectoPRO®  1ml 卵白和抗体坐褥专用，悬浮的293、CHO细胞转染 114-01 jetPRIME® 1ml 通用型转染试剂，适用于贴壁细胞 AAB-1001 Nucleofector™ 2b Device / 电转仪 V4XP-3024 P3 Primary Cell 4D X Kit L 100ul 电转试剂盒 336921 SureENTRY Transduction Regent 1EA 慢病毒和逆转录病毒转染试剂 裂解液 abs9229 RIPA裂解液 100ml 细胞裂解液 28941279 Mammalian Cell Lysis Buffer 500ml 哺乳动物细胞裂解液 染色液 abs964 考马斯亮蓝染色试剂盒(老例型)R250 100ml SDS-PAGE卵白电泳凝胶染色

16、卵白纯化到手抒发指标卵白的细胞经过裂解，超声和过滤后可运转进行卵白纯化。标签卵白纯化通常使用2步大略3步纯化形状。 16.1 标签亲和层析证据您构建质粒时接管的标签接管对应的标签亲和层析居品。常用的标签有HIS，GST，MBP，Strep，FLAG等等，这里以His标签预装柱和重力柱为例进行先容。（一） HisTrap HP 预装柱使用说明并吞缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4样品上样前需要过滤，缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。1、 系统耕作一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子并吞到 ӒKTA 纯化仪的接洽上，注重要液滴对液滴进行并吞，注重引入气泡。2、 去除柱子底部的堵头，并吞到纯化仪上。3、 用 3-5 个柱体积的蒸馏水洗去酒精。4、 用 5 个柱体积的并吞缓冲液均衡柱子，提议流速是 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。5、 用上样环大略 superloop 加入预处理的样品（样品在上柱前一定要进行离心和过滤），在上样时提议流速为 0.2-1ml/min（1ml 体积柱子）和 0.5-5ml/min（5ml 体积柱子）。6、 用并吞缓冲液洗涤至少 10 到 15 个柱体积，直到继承峰达到富厚基线或在流出物中莫得物资流出。洗涤过程中提议保捏流速为 1-2ml/min（1ml 体积柱子）和 5-10ml/min（5ml体积柱子）。7、 用洗脱缓冲液采取一步洗脱大略线性梯度洗脱（拉咪唑浓度梯度）。一步洗脱通常 5 个柱体积，线性洗脱通常 10-20 个柱体积。在洗脱过程中保捏流速为 1-2ml/min（1ml 体积柱子）和 5-10ml/min（5ml 体积柱子）。8、 洗脱后，用 3-5 个柱体积的并吞缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%酒精。拧上柱子高下的堵头，注重柱子变干。Note：如果需要去除纯化后样品中的咪唑，提议使用 HiTrap Desalting 脱盐柱大略 PD-10 Dealting 脱盐柱。

（二） Ni Sepharose 6 FF 装重力柱使用说明并吞缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4样品上样前需要过滤，缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。一、 准备 PD-10 空柱1、 用 20%的酒精洗涤滤膜。2、 用蒸馏水润洗滤膜。3、 将滤膜放入 PD-10 空柱。二、 填料准备1、 柔软触动瓶子，直到填料悬浊液均一。2、 将需要量的填料悬浊液从瓶中改变到离心管中。3、 用 500xg 离心 5min 以千里淀填料。4、 惶恐上清，加入适量蒸馏水。5、 柔软的飘浮填料悬浊液 3min， 用 500xg 离心 5min。6、 惶恐上清，加入适量并吞缓冲液，类似容颜 5.7、 把填料悬浊液改变到量筒中。8、 加入适量体积的并吞缓冲液，使悬浊液中的填料浓度达到 50%。三、 重力柱纯化1、 将样品加入含有 50%填料的悬浊液中（样品在上柱前要进行离心和过滤）。 Ni Sepharose 6FF 的平均载量是 40mg/ml。则 1ml 的 50%悬浊液的载量为苟简 20mg 卵白。2、 将样品和填料羼杂物在摇床上低速羼杂 1h。3、 将样品和填料羼杂物加入到 PD-10 的空柱中，蚁集流出物。4、 用并吞缓冲液洗涤 2-5 个柱体积，蚁集流出物。5、 用 4 个柱体积的洗脱缓冲液洗脱，蚁集流出物。

 

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29051021 HisTrap HP           1 × 1 ml His标签卵白纯化 17524701 HisTrap HP            5 × 1 ml His标签卵白纯化 17524801 HisTrap HP            1 × 5 ml His标签卵白纯化 17524802 HisTrap HP            5 × 5 ml His标签卵白纯化 17531901 HisTrap FF            5 × 1 ml His标签卵白纯化 17525501 HisTrap FF            5 × 5 ml His标签卵白纯化 29048586 HisTrap excel  1 x 1 ml His标签卵白纯化 17371205 HisTrap excel           5 x 1 ml His标签卵白纯化 17371206 HisTrap excel         5 x 5 ml His标签卵白纯化 29048631 HisTrap FF Crude  1 × 1 ml His标签卵白纯化 11000458 HisTrap FF Crude  5 × 1 ml His标签卵白纯化 17528601 HisTrap FF Crude  5 × 5 ml His标签卵白纯化 填料 17526801 Ni Sepharose HP 25 ml His标签卵白纯化 17526801 Ni Sepharose HP 25 ml His标签卵白纯化 17526802 Ni Sepharose HP 100 ml His标签卵白纯化 17531806 Ni Sepharose 6 FF 5 ml His标签卵白纯化 17531801 Ni Sepharose 6 FF 25 ml His标签卵白纯化 17531802 Ni Sepharose 6 FF 100 ml His标签卵白纯化 17531803 Ni Sepharose 6 FF 500 ml His标签卵白纯化 17371201 Ni Sepharose excel 25ml His标签卵白纯化 28967390 His Mag Sepharose Ni 5x1ml His标签磁珠 28967388 His Mag Sepharose Ni 2x1 ml His标签磁珠

 

GST标签卵白纯化联系居品

  货号 品名 规格 用途 预装柱 17528101 GSTrap HP  5 × 1 ml GST标签卵白纯化 17528201 GSTrap HP  1 × 5 ml GST标签卵白纯化 17528202 GSTrap HP  5 × 5 ml GST标签卵白纯化 17513001 GSTrap FF  5 × 1 ml GST标签卵白纯化 17513101 GSTrap FF  1 × 5ml GST标签卵白纯化 17513102 GSTrap FF  5 × 5ml GST标签卵白纯化 29048609 GSTrap 4B  1 × 1 ml GST标签卵白纯化 28401747 GSTrap 4B  1 × 5 ml GST标签卵白纯化 填料 17527901 Glutathione Sepharose HP 25 ml GST标签卵白纯化 17527902 Glutathione Sepharose HP 100 ml GST标签卵白纯化 17513201 Glutathione Sepharose 4 FF 25 ml GST标签卵白纯化 17513202 Glutathione Sepharose 4 FF 100 ml GST标签卵白纯化 17075601 Glutathione Sepharose 4B 10 ml GST标签卵白纯化 17075605 Glutathione Sepharose 4B 100 ml GST标签卵白纯化 切除酶 27084301 PreScission Protease 500 units GST标签切除酶 27084601 Thrombin Protease 500 units GST标签切除酶

Strep标签卵白纯化联系居品

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29401317 StrepTrap XT 1 × 1 ml Strep标签卵白纯化 29401320 StrepTrap XT 5 × 1 ml Strep标签卵白纯化 29401322 StrepTrap XT 1 × 5 ml Strep标签卵白纯化 29401323 StrepTrap XT  5 × 5 ml Strep标签卵白纯化 填料 29401324 Strep-Tactin XT Sepharose 10ml Strep标签卵白纯化 29401326 Strep-Tactin XT Sepharose 50ml Strep标签卵白纯化

MBP标签卵白纯化联系居品

  货号 品名 规格 用途 预装柱 28918779 MBPTrap HP 1 × 5 ml MBP标签卵白纯化 29048641 MBPTrap HP  1 × 1 ml MBP标签卵白纯化 28918778 MBPTrap HP  5 × 1 ml MBP标签卵白纯化 28918780 MBPTrap HP  5 × 5 ml MBP标签卵白纯化 填料 28935597 Dextrin Sepharose HP 25 mL MBP标签卵白纯化 28935598 Dextrin Sepharose HP 100 mL MBP标签卵白纯化

16.2 离子交换离子交换需要证据您卵白的等电点接管阴离子交换柱大略阳离子交换柱。1、如果您的卵白的等电点小于缓冲液的PH，则接管阴离子交换柱（Q，DEAE）；2、如果您的卵白的等电点大于缓冲液的PH，则接管阳离子交换柱（S，SP，CM）；这里以Q柱为例进行先容。

并吞缓冲液：缓冲液的PH比指标卵白的等电点高一个PH。推选缓冲液： 洗脱缓冲液：并吞缓冲液+1M NaCl样品上样前需要过滤，置换到并吞缓冲液中。缓冲液需要预先过滤和超声去除气泡。

1、 系统耕作一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子并吞到 ӒKTA 纯化仪的接洽上，注重要液滴对液滴进行并吞，注重引入气泡。2、 去除柱子底部的堵头，并吞到纯化仪上。3、 用 3-5 个柱体积的蒸馏水洗去酒精。4、 用 5 个柱体积的并吞缓冲液均衡柱子，提议流速是 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。5、 用上样环大略 superloop 加入预处理的样品（样品在上柱前一定要进行离心和过滤），在上样时提议流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。6、 用并吞缓冲液洗涤至少 5个柱体积，直到继承峰达到富厚基线或在流出物中莫得物资流出。洗涤过程中提议保捏流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml体积柱子）。7、 用洗脱缓冲液采取一步洗脱大略线性梯度洗脱（拉NaCl梯度）。一步洗脱通常 5-10 个柱体积，线性洗脱通常 10-20 个柱体积。在洗脱过程中保捏流速为 1ml/min（1ml 体积柱子）和 5ml/min（5ml 体积柱子）。8、 洗脱后，使用5个柱体积并吞缓冲液+1M NaCl进行再生，然后用 5-10 个柱体积的并吞缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%酒精。拧上柱子高下的堵头，注重柱子变干。

 

  货号 品名 规格 用途 预装柱 28934388 HiTrap Capto IEX Selection Kit 5根不同柱子 阴、阳离子不同配基预装柱 29275878 Capto HiRes Q 5/50 5 x 50mm 高分辨率阴离子交换柱 29275881 Capto HiRes Q 10/100 10 x 100mm 高分辨率阴离子交换柱 29275877 Capto HiRes S 5/50 5 x 50mm 高分辨率阳离子交换柱 29275879 Capto HiRes s 10/100 10 x 100mm 高分辨率阳离子交换柱 29051325 HiTrap Q HP 1 × 1 ml 阴离子交换柱 17115301 HiTrap Q HP 5 × 1 ml 阴离子交换柱 17515601 HiTrap Q FF  5 × 5 ml 阴离子交换柱 11001302 HITRAP CAPTO Q， 5X1ML 5 × 1 ml 阴离子交换柱 11001303 HiTrap Capto Q  5 × 5 ml 阴离子交换柱 29051324 HiTrap SP HP 1 × 1 ml 阳离子交换柱 17115101 HiTrap SP HP 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17115201 HiTrap SP HP 5 × 5 ml 阳离子交换柱 17505401 HiTrap SP FF 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17515701 HiTrap SP FF  5 × 5 ml 阳离子交换柱 17544122 HITRAP CAPTO S， 5X1 ML 5 × 1 ml 阳离子交换柱 17544123 HiTrap Capto S 5 × 5 ml 阳离子交换柱 17505501 HiTrap DEAE FF  5 × 1 ml 弱阴离子交换柱 17515401 HiTrap DEAE FF  5 × 5 ml 弱阴离子交换柱 28916537 HiTrap Capto DEAE， 5X1ML 5 × 1 ml 弱阴离子交换柱 28916540 HiTrap Capto DEAE 5 × 5 ml 弱阴离子交换柱 17515501 HiTrap CM FF  5 × 5 ml 弱阳离子交换柱 28405846 HiTrap Capto adhere  5 × 5 ml 阴离子交换柱 填料 17531610 CAPTO Q， 25 ML 25 ml 阴离子交换填料 17531602 Capto Q 100 ml 100 ml 阴离子交换填料 17051010 Q Sepharose FF 25 ml 阴离子交换填料 17051001 Q Sepharose FF 300 ml 阴离子交换填料 17544110 CAPTO S， 25 ML 25 ml 阳离子交换填料 17544101 CAPTO S， 100 ML 100 ml 阳离子交换填料 17072910 SP Sepharose FF 25 ml 阳离子交换填料 17072901 SP Sepharose FF 300 ml 阳离子交换填料 17544301 CAPTO DEAE， 100 ML 100 ml 阴离子交换填料 17070910 DEAE Sepharose FF 25 ml 阴离子交换填料 17070901 DEAE Sepharose FF 500 ml 阴离子交换填料 17071910 CM Sepharose FF 25 ml 阳离子交换填料 17071901 CM Sepharose FF 500 ml 阳离子交换填料 17544410 Capto adhere 25 ml 多模式填料

16.3  凝胶过滤层析凝胶过滤层析主要用于良好纯化大略去除多聚体。凝胶过滤层析主要证据上样量和卵白分子量进行接管。这里以Superdex 200 Increase 10/300为例进行先容。

缓冲液的接管：缓冲液不错证据您的样品大略下流愚弄进行接管，由于在极低盐浓度的情况下，酸性和碱性卵白质都可能发生离子互相作用，因此推选的缓冲液是 0.01 至 0.05 M 磷酸钠再加上0.15 M NaCl，pH 7.4。

样品处理：分子量：10KD-600KD上样体积：25-500ul卵白浓度：样品中最多50 mg/mL，在低于10 mg/mL时可取得更高的分辨率。准备：将样品溶解在缓冲液中，10 000 g 离心10 分钟，用0.22 μm 过滤器过滤。

1、证据层析柱的耐压在系统中耕作柱前压和delta压2、系统耕作一个低流速， 移除预装柱顶部的堵头，把柱子并吞到 ӒKTA 纯化仪的接洽上，注重要液滴对液滴进行并吞，注重引入气泡。3、去除柱子底部的堵头，并吞到纯化仪上。4、以0.75 mL/min 的流速使用至少 2 个柱体积 (CV) 的室温去离子水进行均衡。5、以0.75 mL/min 的流速用至少 2 个柱体积 (CV) 缓冲液均衡层析柱。6、以0.75 mL/min 的流速进行上样和煦冲液洗脱。7、纯化结束后，用2CV的去离子水清洗柱子，然后填充20%酒精。拧上柱子高下的堵头，注重柱子变干。

  货号 品名 规格 用途 预装柱 29219757 Superdex 30 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤0-7KDa 29148721 Superdex 75 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 28990945 Superdex 200 Increase 5/150 GL 5 x 150 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL 10 x 300 mm 凝胶过滤 5-5000KDa 28989333 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 16 x 600 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28989334 HiLoad 26/600 Superdex 75 pg 26 x 600 mm 凝胶过滤 3-70 KDa 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 16 x 600 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 28989336 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 26 x 600 mm 凝胶过滤 10 -600 KDa 17090501 SUPERDEX 30 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤0-7KDa 17104401 SUPERDEX 75 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤 3-70 KDa 17104301 SUPERDEX 200 PREP GRADE 150 ML 150ml 凝胶过滤 10 -600 KDa 填料 17059901 Sephacryl S-300 HR 750ml Sephacryl 凝胶填料 17058410 Sephacryl S-200 HR 150ml Sephacryl 凝胶填料 17003301 Sephadex G-25 Medium 100 g Sephacryl 凝胶填料 17003302 Sephadex G-25 Medium 500 g Sephacryl 凝胶填料   17004301 Sephadex G-50 Medium 100 g Sephacryl 凝胶填料 分子筛Marker 17036001 Blue Dextran 2000 10g 10g 笃定凝胶柱中的闲静体积

17、跑胶封锁纯化后的卵白大小和纯度封锁可用SDS-PAGE跑胶进行封锁。17.1 配胶：拿出电泳仪的制胶架，干净的玻璃板，夹紧玻璃板。先配制基层的分离胶。用烧杯大略锥形瓶按照以下配方进行配制。   摇匀，用移液枪平缓加入玻璃板中，注重尽量不要产不悦泡。用1ml无水酒精大略蒸馏水，压在分离胶上头。待分离胶凝固后，倒出表层的无水酒精大略水，用滤纸吸干。按照以下配方配制表层浓缩胶。 摇匀，用移液枪平缓加入玻璃板中，注重尽量不要产不悦泡。插入梳子。17.2 上样把制备好的凝胶从制胶架上取下来，放入电泳槽中。电泳槽加入电泳缓冲液。取部分样品和6xloading buffer羼杂，在95℃加热5min。拔出胶上的梳子，把样品加到梳孔中。在掌握的孔中加上卵白Marker。电泳缓冲液配方： 17.3 跑胶盖上电泳仪盖子，插上电源。不错先用80V跑胶，当样品跑入分离胶后，可用220V跑胶。溴酚蓝跑到比拟靠下的位置，罢手跑胶。17.4 染色可用考马斯亮蓝R250进行凝胶染色。这里以爱必信的考马斯亮蓝R250居品说明进行先容。（1）电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液不错充分隐敝凝胶。（2）置于水平摇床或侧摆摇床上平缓摇动，室温染色 1h 或更永劫候。注：具体的染色时候取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时候宜符合延迟。凝胶较薄，温度较高，则染色时候不错符合镌汰。通常染色至凝胶的神态和染色液的神态特出接近，在染色液中确凿看不清凝胶时，不错以为已染色充分。（3）倒出染色液。染色液不错回收类似使用至少 2-3 次。（4）加入适量考马斯亮蓝染色祛除液，确保祛除液不错充分隐敝凝胶。（5）置于水平摇床或侧摆摇床上平缓摇动，室温祛除 4-24h。时间更换祛除液 2-4 次，直至蓝色布景基本上全部被脱去，而且卵白条带染色服从达到预期。通常卵白条带在祛除 1-2h 后即可出现。注：祛除时候过长也会导致卵白条带的神态变浅。（6）完成祛除后，进行不雅察和拍照。上海优宁维生物科技股份有限公司

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